包被原的性質(zhì)很重要，蛋白濃度，是否降解，這關(guān)系到你做出的抗體可不可以被其識(shí)別，所以保留抗原很重要，ELISA試劑盒做重組蛋白時(shí)一定要在冰浴下緩慢融化就是這個(gè)道理。讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些曠地空閑，從而排斥ELISA后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。但有時(shí)因?yàn)樵囼?yàn)的需要，包被原的特殊性也可能采用中性的緩沖溶液來(lái)包。
常用封劑有：0.05%-0.5%的BSA；10%的小牛血清或1%明膠；脫脂奶粉，比較價(jià)廉，可以高濃度使用（5%－10％）；還有一些稀有用到的各種動(dòng)物血清（主要為了排除相似蛋白干擾）和酪蛋白等等。詳細(xì)的試驗(yàn)還要有堅(jiān)固的理論外也要實(shí)踐，看一下可不可以應(yīng)用到自己試驗(yàn)當(dāng)中去。但選用什么，要依據(jù)試驗(yàn)詳細(xì)來(lái)實(shí)踐。
應(yīng)留意以下原理：
ELISA試劑盒因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過(guò)物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體表面的疏水基團(tuán)間的作用，這種物理吸附長(zhǎng)短特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、濃度等的影響，大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團(tuán)，故更易吸附到固相載體表面。小分子必需依賴和大的蛋白載體偶聯(lián)后才能固定在固相載體上。還有有的包被原可能不是蛋白，對(duì)于生物素和脂類物質(zhì)或小分子物質(zhì)我們要事先對(duì)其改造再加以包被，親和素生物素:先親和素先包被載體，加入生物素化的DNA，這種包被方法平均、牢固，已擴(kuò)大應(yīng)用于各種抗原物質(zhì)的定量測(cè)定。常用的包被液除了剛才提到的pH9.6碳酸鹽緩沖液，還有pH7.2的磷酸鹽緩沖液和pH7-8的Tris-HCL緩沖液等等。
我們?cè)谑褂肊LISA試劑盒96孔板的實(shí)驗(yàn)測(cè)定的時(shí)候，常發(fā)現(xiàn)有“邊緣效應(yīng)"，也就是外周孔顯色較中心孔深。經(jīng)研究證實(shí)在溫育中的熱力學(xué)梯度可能是根本原因之所。聚苯乙烯本身為不良熱導(dǎo)體，在實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)ELISA測(cè)定中，將板從室溫（通常在25℃左右）置于37℃溫箱，板也升溫時(shí)，在外周孔與中心孔之間可能存在一熱力學(xué)梯度。因此使用水浴或在將反應(yīng)溶液加入至板孔中時(shí)，將板和溶液均加熱至溫育溫度（如37℃），就可以很容易地排除“邊緣效應(yīng)"，并且可提高測(cè)定的重復(fù)性。
還有就是在實(shí)驗(yàn)中，必然有使用微量加樣器加入樣本的步驟。提醒注意：加樣不可太快，要避免加在孔壁上部，不可濺出和產(chǎn)生氣泡。ELISA試劑盒太快的話無(wú)法保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性。加在孔壁上部的非包被區(qū)，易導(dǎo)致非特異吸附。濺出會(huì)對(duì)鄰近孔產(chǎn)生污染。出現(xiàn)氣泡則反應(yīng)液界面有差異。所以，有時(shí)候一份標(biāo)本用相同的試劑盒這次測(cè)定為陽(yáng)性，下次測(cè)定為陰性，往往就是上述加樣及試劑的錯(cuò)誤所致。
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